Метод Кьельдаля: сущность, стандарты, образцы, оборудование

Метод Кьельдаля — один из самых распространённых способов количественного определения азота в органических веществах. Его используют для определения белков (или других азотсодержащих органических веществ) в мясной и молочной продукции, соках, сырах, пиве, кондитерских изделиях, зерновых и бобовых культурах, лекарственных средствах.

Сущность метода

Датский химик Йохан Кьельдаль создал метод определения общего азота ещё в 1883 году. С тех пор принципиально в методе ничего не поменялось — полученные результаты отличаются точностью и хорошей воспроизводимостью. Все усовершенствования направлены на ускорение процесса (в основном на подбор новых нетоксичных катализаторов) и автоматизацию стадий.

Определение азота в пробе проходит в три этапа.

Органическую пробу, особым образом подготовленную, нагревают с серной кислотой в присутствии катализатора (CuSO₄, солей ртути или каких-то других катализаторов, которые обязательно указаны в стандарте). При этом связанный азот (в виде амино-, амидо-, нитро-, нитрозо-, азо-, азокси-групп) переходит в сульфат аммония (NH₄)₂SO₄. Этот процесс называется озолением или минерализацией.

(CHNO) + H₂SO₄ (изб) → CO₂ + SO₂ + H₂O + (NH₄)₂SO₄

Затем полученный раствор подвергают воздействию концентрированной щёлочи. В результате реакции высвобождается аммиак.

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH → Na₂SO₄ + 2NH₃↑ + 2Н₂О

Полученный аммиак отгоняют в приёмную колбу, в которой находится борная кислота, связывающая его в лабильный комплекс.

NH₃ + H₃BO₃ → NH₃ · H₃BO₃ (III)

На третьем этапе анализа полученный аммиак титруют серной или азотной кислотой. Полученные результаты титрования используют для вычисления массовой доли общего азота и дальнейших расчётов (например, количества общего белка).

Вот так выглядела установка Кьельдаля во времена Кьельдаля

Стандарты

Метод Кьельдаля на сегодняшний день является референтной методикой измерений. Это значит, что результаты измерения могут использоваться для оценки правильности измеренных значений величины, полученных по другим методикам, а также для калибровки или определения характеристик стандартных образцов.

Общие указания по определению содержания азота методом Кьельдаля приведены в ГОСТ 26889-86 (он до сих пор действующий, последняя редакция была 1 марта 2010 года). В нём приведены рекомендации по проведению анализа, но указано, что отдельные моменты могут быть приведены в более специализированных стандартах.

• ГОСТ 34454-2018 распространяется на молочную продукцию (молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты, молокосодержащие продукты с заменителем молочного жира) и устанавливает определение массовой доли общего белка.
• ГОСТ 34536-2019 распространяется на молоко и молочную продукцию (сырое молоко, питьевое молоко, сырые сливки, питьевые сливки, концентраты сывороточных белков) и устанавливает определение массовой доли сывороточных белков.
• ГОСТ 25011-2017 распространяется на мясо и мясные продукты (включая мясо птицы, мясные и мясосодержащие продукты) и устанавливает методы определения массовой доли белка.
• ГОСТ 34111-2017 распространяется на фруктовые и овощные соки (в том числе концентрированные, нектары, сокосодержащие напитки) и устанавливает метод определения массовой доли азота.
• ГОСТ Р 54662-2011 распространяется на сыры, сырные массы и плавленые сыры и устанавливает определение массовой доли белка.
• ГОСТ 10846-91 распространяется на зерно и продукты его переработки и устанавливает метод определения белка.
• ГОСТ 13496.4-2019 и ГОСТ 32044.1-2012 распространяются на корма, комбикорма и комбикормовое сырьё и устанавливают методы определения азота с последующим пересчётом результатов на сырой протеин.
• Фармакопея XIV издание (раздел ОФС.1.2.3.0011.15) распространяется на лекарственные средства и устанавливает определение массовой доли азота.

Все эти стандарты оговаривают, что вместо стандартной стеклянной установки Кьельдаля можно использовать автоматическое оборудование.

Оборудование для анализа по Кьельдалю

Для облегчения и ускорения анализа существует целый комплекс оборудования, которое позволяет значительно упростить работу лаборанта, минимизировать возможные ошибки определения и проводить одновременно серию анализов.

Минерализация

Для осуществления минерализации (первого этапа в анализе) были разработаны специальные сжигатели, которые называют дигесторами (или просто приборами для разложения проб). Они позволяют проводить минерализацию при точной и высокой температуре. Оптимальной температурой для процесса считается 360-380 °С, так как уже при 390 °С начинаются первые потери азота, а при более низких температурах реакция не даёт стопроцентного выхода. Но различные стандарты определяют свою температуру для разных образцов, и она может быть выше: например по ГОСТ 54662-2011 для анализа сыров требуется температура минерализации 420±10 °С, а для анализа молока по ГОСТ 34454-2018 нужен нагрев до 450-500 °С.

Дигесторы позволяют одновременно подготавливать несколько проб, обычно 4, 6, 8 или 12. Объём пробы составляет порядка 200-250 мл. Есть дигесторы, рассчитанные на больший объём пробы: Gerhardt TURBOTHERM TTs 625 позволяет работать с пробами до 300 мл, а TTs 480 до 800 мл.

К дигестору обязательно прилагается скруббер — прибор, который будет улавливать и очищать пары. Он конденсирует агрессивные кислотные пары, нейтрализует их в щёлочи и затем разбавляет водой.

Всё многообразие установок для разложения проб от Gerhardt

Дистилляция

Для ускорения второго этапа — дистилляции — существуют специальные дистилляционные аппараты, которые оснащены встроенным парогенератором и устройством для автоматической подачи в дистилляционную колбу необходимых количеств щёлочи и воды. Дистилляция занимает всего 3-5 мин. В зависимости от степени автоматизации (то есть сложности и стоимости дистиллятора), дистилляторы могут добавлять заданное количество воды и щёлочи, борной кислоты и даже (если они совмещены с титратором) автоматически проводить титрование и выдавать готовый результат.
В моделях Gerhard VAPODEST 200, Beger SDU 100 и LOIP LK-500 пользователь задаёт необходимое количество добавляемой щёлочи и время дистилляции, в VAPODEST VAP 300 можно ещё регулировать количество воды для охлаждения, а VAP 400 в дополнение ко всему позволяет добавить нужное количество борной кислоты.

Различные модели VAP

Титрование

Последний этап анализа — это кислотно-основное титрование аммиака серной кислотой. Борная кислота образует лабильный комплекс с аммиаком. Её добавляют только для того, чтобы избежать потерь аммиака вследствие его испарения, и в титровании она не участвует. Конечную точку титрования можно определить вручную, но намного проще и точнее использовать автоматический титратор. Есть приборы, которые совмещают дистиллятор и титратор, к примеру, у VAP 450 есть внешний титратор и ПО, которое посчитает готовый результат.

Если позволяют средства, то лаборатория может приобрести полностью автоматизированный комплекс для анализа методом Кьельдаля. В работе с ним участие человека сводится к взвешиванию образца и размещению навески в минерализационной колбе, всё остальное комплекс сделает сам.

Полученные результаты анализа выражают в пересчёте на азот (N). Если делается пересчёт на содержание общего белка, то обязательно указывают коэффициент пересчёта. Этот коэффициент и формулировки расчёта будут зависеть от стандарта, по которому проводятся измерения.

Автоматический дистилляционный комплекс

Нужна помощь в подборе оборудования? Менеджеры компании «НВ-Лаб» помогут выбрать оборудование исходя из методик и стандартов, использующихся конкретно в вашей лаборатории. Звоните или пишите:

• Тел.: 8 (800) 500-93-80.
• Email: info@nv-lab.ru.